人源化抗体的改型抗体
改型抗体也称CDR植入抗体(CDRgraftingantibody)，抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。然而，抗原虽然主要和抗体的CDR接触，但FR区也常参与作用，影响CDR的空间构型。因此换成人源FR区后，这种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区，可能改变了单抗原有的CDR构型，结合抗原的能力会下降甚至明显下降。虽然已能对抗体进行分子设计，在人源FR区引入鼠源FR区的某些关键残基，如配置得当，其亲和力可与原有小鼠抗体的亲和力相当，但人化抗体常达不到原有鼠源单抗的亲和力。
人源化抗体原理及常用方法有哪些？
人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。
人源化抗体就是指抗体的恒定区部分（即CH和CL区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。
①基于框架区同源性的CDR移植与回复突变
非人源化抗体人源化的常用方法是互补决定区（CDR）移植，即非人源抗体的CDR区移植到人源抗体框架区上。通常，会选择与非人源抗体框架区同源性最高的人源抗体框架区作为CDR移植的受体。这种方法最主要问题是与特定靶标结合的亲和力会降低乃至丧失。将小鼠抗体的CDR环直接移植到人源抗体框架上在某些情况下不会影响抗体亲和力，然而在多数情况下，它会显著降低亲和力。鼠源抗体框架区的一些残基已被证明会影响CDR环的构象以及抗体的亲和力，我们称其为游标区残基。这些残基位于靠近CDR区的β折叠。因此，在选择所需的人源抗体框架区后，需要对这些残基进行回复突变，使其保留在人源化抗体中。除此之外，可变区外氨基酸残基的突变也已被用于赋予人源化抗体新的特性。
②基于胚系基因的CDR移植
人类胚系基因可作为鼠源抗体人源化框架区的替代来源。与来源于IgG的框架区相比，胚系基因具有较少的克隆内体细胞超突变。因此，人们认为利用胚系框架的人源化抗体比IgG框架的人源化抗体表现出更低的免疫原性。尽管胚系基因的免疫原性可能较低，但事实上IgG的衍生框架有时更有利。复数研究反映，人源化抗体Fc区的变化会影响抗体活性与亲和力。如有研究证实，将鼠抗可变区融合到IgG恒定区构建的嵌合抗体对黄热病感染的预防和治疗有效，而具有IgM恒定区的嵌合抗体则不然。
③抗体表面重塑
抗体表面重塑是非人源抗体人源化的另一种策略。表面重塑是指对非人源抗体的表面氨基酸残基进行抗体人源化改造。该策略的原则是确定鼠源抗体表面残基的位置，在维持抗体活性并兼顾减少抗体免疫原性的基础上，选用与人源抗体表面残基相似的氨基酸进行替换。通过这种方法人源化的抗体通常表现出稳定性和亲和力的变化很小。
④基于CDR同源性的CDR移植
以往的CDR移植通常会选择与非人源抗体框架区同源性最高的人源抗体框架区作为CDR移植的受体。Hwang及其同事首次设计了一种基于CDR区域同源性的抗体人源化新方法。该方法不使用框架区的同源性来选择人源化抗体框架，关键的鼠源残基也不进行回复突变。使用这种方法可以减少被识别为外源物质的可能性。比起基于框架区同源性的CDR移植，通过该方法改造的抗体亲和力维持更好。
⑤SDR移植
通过CDR移植获得的人源化抗体仍可能在患者中引发免疫性抗独特型（anti-Id）反应。为了最大限度地减少抗V区免疫反应，可以通过仅将CDR序列中抗原结合活性所必需的特异性决定残基（SDR）移植到人源抗体框架区上来实现抗体人源化。SDR移植的方法更进一步地提升了抗体人源化程度，并尽可能地减少了鼠源CDR中效应T细胞表位的数量，从而将抗体可变区潜在的免疫原性风险做到最小化。
⑥其他抗体人源化方法
定向筛选或链替换抗体库技术，是利用噬菌体展示的方法，将鼠源抗体重轻链V区结构域分别顺序或平行地替换为人源化的。该方法为人源化提供了一个强大的工具，可以最大限度地减少人体的免疫原性。值得注意的是，通过噬菌体展示技术产生人源化抗体，即使是全人源抗体，也无法消除全部的免疫原性。
目前义翘神州利用CDR置换技术及计算机辅助结构模拟设计可对鼠源单抗等进行人源化改造，保证人源化程度 >95%，为客户提供优质的单克隆抗体人源化服务。更多详情可以参看：https://cn.sinobiological.com/services/antibody-humanization-service
大学理工类都有什么专业
1、通信工程通信工程专业（Communication Engineering）是信息与通信工程一级学科下属的本科专业。该专业学生主要学习通信系统和通信网方面的基础理论、组成原理和设计方法，受到通信工程实践的基本训练，具备从事现代通信系统和网络的设计、开发、调测和工程应用的基本能力。2、软件工程软件工程是一门研究用工程化方法构建和维护有效的、实用的和高质量的软件的学科。它涉及程序设计语言、数据库、软件开发工具、系统平台、标准、设计模式等方面。在现代社会中，软件应用于多个方面。典型的软件有电子邮件、嵌入式系统、人机界面、办公套件、操作系统、编译器、数据库、游戏等。同时，各个行业几乎都有计算机软件的应用，如工业、农业、银行、航空、政府部门等。3、电子信息工程电子信息工程是一门应用计算机等现代化技术进行电子信息控制和信息处理的学科，主要研究信息的获取与处理，电子设备与信息系统的设计、开发、应用和集成。电子信息工程专业是集现代电子技术、信息技术、通信技术于一体的专业。本专业培养掌握现代电子技术理论、通晓电子系统设计原理与设计方法，具有较强的计算机、外语和相应工程技术应用能力，面向电子技术、自动控制和智能控制、计算机与网络技术等电子、信息、通信领域的宽口径、高素质、德智体全面发展的具有创新能力的高级工程技术人才。4、车辆工程车辆工程专业是一门普通高等学校本科专业，属机械类专业，基本修业年限为四年，授予工学学士学位。2012年，车辆工程专业正式出现于《普通高等学校本科专业目录》中。车辆工程专业培养掌握机械、电子、计算机等方面工程技术基础理论和汽车设计、制造、试验等方面专业知识与技能。了解并重视与汽车技术发展有关的人文社会知识，能在企业、科研院（所）等部门，从事与车辆工程有关的产品设计开发、生产制造、试验检测、应用研究、技术服务、经营销售和管理等方面的工作，具有较强实践能力和创新精神的高级专门人才。5、土木工程土木工程（Civil Engineering）是建造各类土地工程设施的科学技术的统称。它既指所应用的材料、设备和所进行的勘测、设计、施工、保养、维修等技术活动，也指工程建设的对象。即建造在地上或地下、陆上，直接或间接为人类生活、生产、军事、科研服务的各种工程设施，例如房屋、道路、铁路、管道、隧道、桥梁、运河、堤坝、港口、电站、飞机场、海洋平台、给水排水以及防护工程等。土木工程是指除房屋建筑以外，为新建、改建或扩建各类工程的建筑物、构筑物和相关配套设施等所进行的勘察、规划、设计、施工、安装和维护等各项技术工作及其完成的工程实体。专业老师在线权威答疑 zy.offercoming.com
理工类包括哪些专业
理工科专业分为理、工、农、医四个学科门类，各学科专业设置如下：一、理学1． 数学类 ：数学与应用数学；信息与计算科学2． 物理学类：物理学；应用物理学3．化学：化学；应用化学4． 生物科学类：生物科学；生物技术5．天文学类：天文学6． 地质学类：地质学；地球化学7． 地理科学类：地理科学；资源环境与城乡规划管理；地理信息系统8． 地球物理学类：地球物理学9． 大气科学类：大气科学；应用气象学10． 海洋科学类：海洋科学；海洋技术. 海洋学11． 力学类：理论与应用力学12． 电子信息科学类：电子信息科学与技术；微电子学；光信息科学与技术13． 材料科学类：材料物理；材料化学扩展资料：理工类专业是指研究理学和工学两大学科门类的专业。理工，是一个广大的领域包含物理、化学、生物、工程、天文、数学及前面六大类的各种运用与组合。理工事实上是自然、科学、和科技的容合。理学是中国大学教育中重要的一支学科,是指研究自然物质运动基本规律的科学,大学理科毕业后通常即成为理学士。与文学、工学、教育学、历史学等并列，组成了我国的高等教育学科体系。工学研究的是技术，要求研究的越简单，能把生产成本降的越低越好；理科重视的基础科研，工科重视的实际应用。理科培养科学家，工科培养工程师。科学生适合专业：软件行业自然是首选，软件行业每年的人才缺口数以万计，而社会能提供的人才往往无法满足社会的需求，做软件的优势潜在的市场开拓空间巨大，具备无限的商机和利润，其次软件业是高新技术产业，简单的说就是需要高智商才能从事的行业，理科学生从事的最优选择。企业选择员工看到就是专业技术的掌握程度，所以专业就是择业的前奏，选择什么样的专业，那未来很大程度上会从事相应的职业。企业招聘中一些企业明文规定，需要本专业学生，所以专业就是择业踏入职场的敲门砖。怎样在众多人群中脱颖而出，自身的专业技术是关键。其次，理科自身的优势，应该选择高端行业，因为本身具备逻辑分析能力、空间立体感等优势，根据自己的特长来选择专业，轻松应对以后课程的理解和掌握。最后理科选择专业的范围很广，专业最终标准看重的还是未来的发展前景。参考资料：百度百科——理工类专业
人源化抗体是如何制备的？protocol越详细越好。
据我了解。。以G抗体来讲。。除了超变区的CD1，CD2，CD3保留鼠源化之外。。其他的地方全部人源化。。可以产生两种：1》人鼠嵌合抗体和2》完全人源化抗体，具体的原理是1》利用基因重组技术，先得到鼠单抗重轻链可变区的基因片段，将其插入控制人单抗恒定区的基因载体上，表达便可以产生嵌合式抗体。。2》首先将小鼠表达鼠源化单抗重轻链的基因剔除，制备表达人源化单抗重轻链基因的转基因小鼠，上诉两种小鼠进行回交，产生只表达人lg的小鼠，用抗原免疫之后即可获得。。我就知道这些啦，，希望对你有所帮助，累死我啦
重组抗体的类型及生产流程
重组抗体的类型及生产流程
??重组抗体，也称为基因工程抗体，是指通过DNA重组技术将抗体相应的基因序列根据需要进行改造和重组，并构建在质粒上，再通过蛋白外源表达技术将构建好的质粒转染/转化入适合的宿主细胞表达获得的抗体。重组抗体很好的解决了动物源抗体引起的人体排斥反应，使得抗体实现人源化，使抗体的效能更为完善
抗体生产的三个阶段
??抗体广泛应用于疾病的诊断和治疗，是研究和应用领域最有价值的研究对象之一。抗体制备技术经历了三个阶段，第一阶段，通过抗原免疫高等动物，从动物的血清中纯化获得抗体，该抗体为多克隆抗体；第二阶段，杂交瘤技术问世，通过将无限增殖的骨髓瘤细胞与产生抗体的B淋巴细胞融合生产出针对单一抗原决定簇的单克隆抗体；第三阶段，通过基因工程技术改造动物生产的单克隆抗体的基因序列，使单抗性能更加符合应用需要，并能通过大规模细胞培养获得，该阶段抗体为重组抗体。
重组抗体有哪些类型？
重组抗体分为五大类：嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体、小分子抗体、双特异性抗体
嵌合抗体
抗体的恒定区和可变区分别来源于不同的物种，常见的嵌合抗体是将动物源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合。
嵌合抗体的特点：
1.抗体可变区为动物源区域，保留了抗体对抗原的特异性和亲和性;
2.抗体有近70%的部分是人源的，很大程度上降低了抗体的异源性，其中人源性Fc片段能有效介导ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应）和CDC（补体依赖的淋巴细胞毒效应）作用；
3.可以根据需要选择不同的抗体类型、亚型、大小、修饰位点等；
4.通过成熟的质粒构建体系及蛋白表达平台，可高效大量的获得目的抗体。
嵌合抗体的生产方式：
人源化抗体
将人抗体的CDR区域替换成动物源单抗的CDR，也称CDR嫁接抗体。
CDR ：即互补决定区（complementarity－determining regions），抗体每个可变区含有三个氨基酸顺序超变区，这些超变区是抗原的结合位点，与抗原决定簇结构互补，被称为CDR。可变区里其他氨基酸作为骨架支持部分，称为框架残基（Framework Residue）。
人源化抗体特点：
1.人源化抗体在嵌合抗体的基础上将抗体中人源性区域进一步扩大，人源化比例可达80%-90%，使得抗体在应用过程中降低人体的异源排斥反应；
2.CDR与抗原结合过程受到FR区域的影响，动物源CDR与人源Fr结合，可能会改变抗体原有CDR的空间结构，进而降低重组抗体与抗原的亲和力。在设计人源化抗体时，可将人源FR区域的关键性氨基酸残基更改为动物源FR，以减少对CDR结构域的影响。
人源化抗体生产方式：
全人源化抗体
采用基因敲出技术将动物抗体基因敲除，造成动物抗体基因缺失，将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，移至抗体基因缺失动物中，通过动物表达人类抗体，达到抗体完全人源化。
采用动物基因敲除和插入的方式获得抗体，操作难度大，成本高，并且依然存在人体排斥反应，噬菌体展示技术应运而生。将人抗体的可变区基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，人抗体可变区随噬菌体外壳蛋白的表达而表达，同时，随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。再通过展示库筛选和细胞表达获得全人源抗体。
重组抗体的载体如何选择？
全人源化抗体特点:
全人源化抗体对人体的免疫原性极小，是抗体药研发最重要的对象，在疾病和癌症的治疗中具备广泛的应用，非常具备研究和生产价值。
全人源化抗体生产方式:
小分子抗体
小分子抗体顾名思义是分子量较小的抗体，一般为完整Ig的一部分，现有的小分子抗体有Fab、Fv、 scFv、SdAb、微抗体、纳米抗体。
小分子抗体特点:
小分子抗体分子量大小只有完整Ig大小的1/12~1/2，穿透性强，同时具备抗原亲和力，并且可通过基因工程系统来操作编辑，通过各种重组蛋白表达系统来大量生产。
小分子抗体生产方式:
双特异性抗体
具备两种特异性抗原结合位点的抗体，可同时与两种抗原结合，例如可同时结合靶细胞（癌症细胞）和效应细胞（T细胞），定向介导效应细胞对靶细胞的杀伤作用，是抗体药物领域的重要研究对象，在肿瘤治疗方面具有卓越的成效。
双特异性抗体特点:
1. 拥有两种特异性抗原结合位点，作为抗体药物，是治疗肿瘤的“抗体炸弹”，比普通的抗体药具有更强的导向性、更强的治疗效果，是最为理想的肿瘤治疗药物；
2. 自然状态不存在，只能通过人工制备获得。
双特异性抗体生产方式:
类型 技术手段
含Fc双特异性抗体Triomabs
Knobs-into-holes
Crossmab
Two-in-one
不含Fc双特异性抗体BiTE
DART
TandAbs
bi-Nanobody
关于弥漫性大B细胞恶性淋巴瘤，烦请专家回答！
癌症的分子标靶治疗
Molecular-targeted Therapy in Cancer
陈若白 黄敬伦 郑安理
台大医院 肿瘤医学部
一,前言
临床肿瘤学的快速进展始於1960至1970年代,当时原本难以控制的何杰金氏症
(Hodgkin disease,HD)及生殖细胞癌,成功地以化学治疗(化疗)治愈,之后也陆续发
现许多癌症对化疗相当敏感(chemosensitive),而且可以藉由化疗控制转移性癌症的恶化.
近四十年来随著分子生物学的突破与各种研究工具的进步,使得人们可以深入地了解癌症生
物学及临床进程.另一方面,化疗药品陆续上市,众多大规模且严谨的临床试验,许多局部
侵犯严重的癌症都可藉由整合手术,放射线治疗与化疗提升治愈率,例如乳癌,大肠直肠癌,
骨癌与卵巢癌等.转移性癌症病人的存活期也因为组合性化疗(combination chemotherapy)
的进步而不断提升.
在1990年代晚期至2000年代初期,肿瘤科医师可使用的新药比起过去的三十年增加了
许多,如paclitaxel,docetaxel,gemcitabine,irinotecan,oxaliplatin及pemetrexed等;
许多癌症的治疗也因此有了长足的进步,如乳癌,卵巢癌,肺癌,胃癌,食道癌,胰脏癌,
膀胱癌,大肠直肠癌,和恶性肋膜间皮瘤等.在另一方面,虽然有如此多的新一代化疗药物,
许多大规模的临床试验却指出,癌症整体存活率并没有随著使用更多化疗药物而有更进一步
增加,反倒是毒性变多了,抗药性的问题也依然存在(1,2).
为了进一步改善治疗成绩,发展低毒性的治疗,科学界与药厂於是利用癌症分子生物学
深入了解,寻求新的药物作用标靶.这些可能成为药物作用的标靶包括了癌细胞具有的特殊
抗原,特殊生长因子受体,肿瘤血管新生相关因子,癌细胞特殊讯息传递路径中的各类分子,
及癌细胞内细胞周期和细胞凋亡之调控分子.这些重要的分子标靶多数因为肿瘤形成过程中
的基因突变,甚至是病毒感染而过度表现於癌细胞,进而影响肿瘤的存活,增殖,局部侵犯
及远端转移.发展新的药物来调控这些重要的标靶很可能在不增加化学治疗毒性的情况下提
高癌症的治疗成绩(3).这也就是癌症的分子标靶治疗(molecular-targeted therapy)的概念.
一个理想的分子标靶应有下列特点:(1)大多数癌细胞有此标靶且大量表现,(2)与癌
症的致病机转相关,(3)与癌细胞的生存功能有关,(4)其功能对正常细胞则非必要或较少
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表现,(5)此分子标靶在肿瘤中少有变异性或突变率低,(6)不易由细胞表面脱落或分泌(2).
自1990年代末期起,标靶治疗的新药如雨后春笋般推出,许多药物都有令人惊喜的疗
效,并且已经上市.兹简单於此篇章介绍临床肿瘤学之分子标靶治疗,并把内容大致分为单
株抗体,表皮生长因子受体相关标靶,血管新生相关标靶与讯息传递路径有关的标靶.
二,单株抗体(monoclonal antibody)
为了方便说明,把与表皮生长因子受体有关的单株抗体(如cetuximab和trastuzumab)
及与血管新生相关的单株抗体(如bevacizumab)放在后文有关章节再讨论,这裏介绍的是
治疗白血病(leukemia)及淋巴瘤(lymphoma)的单株抗体.
1. 理论基础
单株抗体是一种经基因转殖技术制造的免疫球蛋白,可区分为抗原接合区(Fab domain)
与Fc区(Fc domain).单株抗体的抗原结合区接合癌细胞上的特殊抗原后,可能经由三种
机转对癌细胞产生毒杀作用:(1)抗体依赖型吞噬细胞毒杀作用(antibody-dependent cellular
cytotoxicity): 经由Fc区活化具有Fc受体的自然杀手细胞或毒杀型T细胞,对癌细胞产生
毒杀作用.吞噬细胞上的Fc受体的变异性,会影响受体与单株抗体Fc区接合能力(binding
affinity)的强弱程度不一,而影响单株抗体的疗效,甚至会造成抗药性.(2)补体依赖型细
胞毒杀作用(complement-dependent cytotoxicity): Fc区活化补体形成膜攻击复合体
(membrane attack complex)造成癌细胞的崩解.(3)抑制表面受体相关的细胞内讯息传
递:单株抗体接合癌细胞表面的受体标靶后,使受体进入细胞并减少受体与胞外的生长因子
结合,如此可以影响特殊讯息传递路径造成细胞凋亡(图一).
一个理想的标靶抗原只在肿瘤细胞上表现,或是除了癌细胞外仅在非维生器官上表现,
使单株抗体不致对正常细胞有太多伤害.标靶抗原在肿瘤细胞上表现率要高且不易突变.另
外标靶抗原被破坏后会影响癌细胞的重要生理功能及存活.理想的标靶抗原不会从肿瘤细胞
脱落或分泌,避免单株抗体在接合癌细胞前就在循环中被这些脱落的抗原中和.当单株抗体
接合上标靶抗原后,抗原本身最好不会有一连串构造调整的变化,如此才能确保最佳的抗癌
效果.
单株抗体的制备可以是(1)都是老鼠来源的免疫球蛋白(murine antibody,药名以momab
结尾),(2)一半老鼠一半人体来源的复合抗体(chimeric antibody,药名以ximab结尾),(3)
类人体来源的单株抗体(humanized antibody,药名以zumab结尾).鼠源的单株抗体容易
在使用於人体后,在体内产生人类抗老鼠免疫球蛋白的抗体(human anti-mouse antibody,
HAMA),导致输注时的不良免疫反应(infusion-related reaction,如发烧畏寒),而减低单株
抗体的疗效.
有一些方式可以增加单株抗体的疗效,例如:(1)接上放射性同位素(radioimmuno-
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conjugate),让单株抗体接上肿瘤细胞后,兼有放射治疗之效.(2)接上细胞毒素或化疗药
物(immunotoxin or chemo-immunoconjugate).(3)接上细胞激素(如IL-2)以加强补体
及吞噬细胞毒杀作用(immunocytokine).(4)双特异性抗体,单株抗体的两个抗原接合区
之一是针对癌细胞的标靶抗原,另一个抗原接合区则会针对吞噬细胞上的特异抗原,以加强
其细胞毒杀作用(例如bispecific CD19/CD3,一端针对B细胞上的CD19,一端会接合毒杀
性T细胞上的CD3,让表现CD19的B细胞淋巴瘤,更容易被毒杀性T细胞破坏(4).(图二)
图一,抗体依赖型吞噬细胞毒杀作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC)
Immunoglobulin即免疫球蛋白,开叉处为Fab区,用来接合要被毒杀细胞上的特殊抗原;
另一边直线端即Fc区,可和自然杀手细胞(NK cell)和巨噬球(macrophage)上的Fc受体结合,
让这些吞噬细胞来进行对目标细胞的毒杀作用(5).
2. 在恶性淋巴瘤与白血病的临床应用
Rituximab(Rituxan )
Rituximab是攻击CD20的单株抗体.因为CD20在绝大部份(90%)的B淋巴瘤细胞
上都有表现,所以研发攻击CD20的单株抗体来治疗B细胞恶性淋巴瘤很自然地成为焦点.
Rituximab一开始应用在low grade B or follicular non-Hodgkin′s lymphoma(NHL),针对复
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发或对化疗具抗药性的病人每周输注375 mg/m2,连续四周.整体反应率达48%,完全缓解
率为6%,有三至四成病人发生输注抗体造成的发烧寒颤反应,但越后面的疗程就越少发生
(7).美国食品药物管理局(FDA)於1997年11月26日核准其治疗复发或对化疗具抗药性
的low grade B or follicular non-Hodgkin′s lymphoma(NHL).因为正常的B淋巴球上也有
CD20,rituximab的使用会减少B细胞数目,造成体液免疫功能下降而容易感染.以rituximab
作第一线治疗单独用於分期高但细胞形态较好,且没有症状的follicular lymphoma病人,也
有不错的成效;但是病人若有较高的乳酸脱氢酶(LDH),其治疗反应较差(8).Rituximab也
被使用在与化疗合用以增加疗效,通常是用在分期较高且有症状的病人身上.另外在经过化
疗或rituximab加化疗得到缓解后,也可用rituximab用来作维持疗法(maintenance therapy)
以保持缓解状态.
图二,双特异性抗体(bispecific CD19/CD3)作用图
此双特异性抗体有两个Fab区,一个接合上B细胞淋巴瘤上的CD19,一个接合上毒杀性
T细胞上的CD3,让毒杀性T细胞可以更直接地破坏淋巴瘤细胞(6).
Rituximab与化疗CHOP(cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine,prednisolone)
合并治疗的处方称为R-CHOP,可用来治疗分期较高且有症状的low grade B or follicular
non-Hodgkin′s lymphoma(NHL).CHOP共给6个疗程,每个疗程前一天给一次rituximab,
在第一疗程开始之前及整个疗程结束之后各额外给两次rituximab;此外在第2与第3,第4
与第5疗程之间也额外给一次rituximab,共使用12次.在最近的重要研究中,针对治疗过
和没有治疗过的病人使用R-CHOP,反应率都高达100%,完全缓解率为87%,反应维持的
中位期为83.5月.至於follicular lymphoma常有的染色体14和18转位,也有很高比例在
病人达到完全缓解后消失,即所谓的分子层次缓解(molecular remission)(9).R-COP(无
doxorubicin,毒性较少)可用来治疗年纪大或体力情况较差的患者,也有不错的效果(10).另
外,rituximab与fludarabine或novantrone合并使用治疗low grade B NHL,也有极高的反
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应率及治疗维持效果(11).不过,follicular lymphoma是相当难治愈的肿瘤,就算有长达7年
的疾病控制,但最终能否治愈病人仍需更长时间的观察.正因为以上所提不错的治疗成果,
R-CHOPヽR-COP和R-FND(rituximab+fludarabine+novantrone+dexamethasone)目前已
用於测试分期较高的low grade B or follicular non-Hodgkin′s lymphoma(NHL)的第一线治
疗(12).
CHOP被公认为治疗弥漫性大细胞非何杰金氏淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,
DLBC)或其他高恶性度淋巴瘤的第一线标准化学治疗,因为有很好的疗效,而且比其他处
方有较少的毒性(13).当rituximab开始应用时,使用rituximab合并第一线CHOP治疗DLBC
的研究也开始进行.德国GELA第三期临床试验,针对60岁以上的DLBC病人,随机分配
成两组分别使用R-CHOP与CHOP.研究结果显示,完全缓解率分别为R-CHOP组76%和
CHOP组63%,达到统计上显著差异;而无论高低危险群的病人整体存活率都是R-CHOP
组较好.此外也发现若病人为Bcl-2阳性,使用R-CHOP的帮助会更大(14).至於R-CHOP
使用於60岁以下病人的成效,却一直没有很好的临床试验来证明比单用CHOP更优异.直
到2004年才有第三期的临床试验,针对60岁以下的低危险群病人使用R-CHOP与CHOP
治疗,研究结果显示两年整体存活率在R-CHOP组为95%,CHOP为85%,统计上有显著
差异(15).但是只有半数病人有大体积的淋巴结,临床上较严重的患者并没有加入,而且追踪
期还不够久,真正的疗效仍有待更久的观察与更多的临床试验来验证.
Rituximab也被应用於治疗接受干细胞移植的淋巴瘤患者.若病人在接受自体干细胞移
植前三个月内有接受过rituximab的治疗,其整体存活率比起没有使用过或大於三个月前使用
的病人较高(16).
在预后不佳的冠细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma),单独使用rituximab的效果很差,
目前的临床试验著重在以rituximab加上交替使用hyperCVAD(cyclophosphamide,
vincristine,doxorubicin,dexamethasone)和methotrexate/ Ara-C化疗;或是在自体干细
胞移植后作为维持性疗法(17).
CD20在B细胞慢性淋巴性白血病(B-CLL)的血癌细胞上亦有表现,但未曾治疗过的
血癌细胞上CD20表现较多.Rituximab用於B-CLL的治疗方式是每周给予375 mg/m2,连
续四周.在未曾治疗过的病人族群,其整体反应率为60%- 90%,而完全缓解率将近两成;
至於使用在复发或对化疗有抗药性的病人,其反应率为10%- 40%,而且少有达到完全缓解
的病人.其效果较差的原因除了CD20在这群病人的表现率较低外,因病情较严重,淋巴球
细胞在循环中过度增生,造成rituximab在血液中的半衰期变短;而且这些CLL细胞会将CD20
分泌至血液中,造成rituximab连结到真正在CLL细胞表面的CD20的比例变少.为了增加
未曾治疗过的病人对rituximab的反应率,可与化疗药物如fludarabine和cyclophosphamide
一起使用(18).
因为CD20几乎都会在Waldenstrom′s macroglobulinemia(WM)的癌细胞上表现,所
以也可用rituximab来治疗WM.初步临床试验的结果显示反应率约为三~四成.若与化疗药
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物cladribine和cyclophosphamide合用在未曾治疗过的病人身上,整体反应率为94%,完
全缓解率则为18% (19).
Yttrium-90 ibritumomab(Zevalin )与Iodine-131 tositumomab(Bexxar )
Low grade B or follicular non-Hodgkin′s lymphoma(NHL)在只有局部疾病时,是很容
易以放射疗法杀死的,因此结合放射性同位素和抗CD20单株抗体的复合物,最近成为这些
淋巴瘤的一种治疗方式.放射线同位素加上单株抗体之后,在肿瘤部位可能释放出alphaヽ
beta与gamma射线.Gamma射线能量不强,主要用在放射线同位素显像以确认肿瘤位置;
beta射线能量中等,但含盖范围较广,正常细胞可能也会造成毒害,主要用於大体积的肿瘤;
alpha射线能量最强,但含盖范围窄,通常用於清除残存的小肿瘤,较不会伤害到正常组织.
最常用的两种放射线同位素是铱90(Y-90)和碘131(I-131).两种新抗体分别为Y-90
ibritumomab和I-131 tositumomab.Y-90先得到重视是因为它比I-131在肿瘤累积较高浓
度,而且半衰期较短且不会释放gamma射线,毒性较低.另外I-131会在不同病人身上以不
同速率去碘化,去碘的过程中也会代谢掉有效的抗体成份,而分解出的碘会沉积在甲状腺,
胃黏膜,泌尿道等处,因此使用I-131 tositumomab需计算全身可能曝露的剂量.
这一类放射性同位素单株抗体的给药方式比较复杂.以I-131 tositumomab的治疗为例,
分为计量步骤(dosimetric step)与治疗步骤(therapeutic step).在计量步骤第一天先给予
没有标记放射性同位素的单株抗体,目的是清除周边循环中CD20阳性的B淋巴球,以利於
后来放射线同位素能顺利在肿瘤部位发挥作用而不受干扰.同一天再给予有放射线同位素标
记的单株抗体以显影肿瘤部位,一般是5mCi(毫居里)的I-131 tositumomab.当天与之后
的七天内共要作三次扫描以确定肿瘤位置,与计算全身曝露剂量.计量步骤开始后的第八天
为治疗步骤,会再给予一次没有标记的tositumomab,以接合在肿瘤外侧的CD20,让之后
具治疗剂量的标记抗体可以穿越至肿瘤中间发挥作用,随后给予含全身曝露剂量0.75格雷
(Gy)的I-131 tositumomab作为标准治疗.
第一期的Y-90 ibritumomab和I-131 tositumomab的临床试验显示大致有七成的整体反
应率和三成的完全缓解率,但因I-131 tositumomab为纯老鼠来源的抗体,容易产生HAMA,
会产生输注时的不良反应而减低疗效.使用这类含放射性同位素的抗体时要注意下列事项:
周边淋巴球小於5000 / L,以免浪费太多抗体於周边血液中;骨髓被淋巴瘤侵犯的比例少於
25%,以免增加骨髓抑制;另外,Y-90 ibritumomab会累积在病人的胸水或腹水中,也较易
造成骨髓抑制;使用I-131 tositumomab者必须有通畅的泌尿道以利I-131排泄,且I-131
tositumomab会造成甲状腺功能低落,或因放射线曝露来造成次发性白血病,胃癌,泌尿道
癌症等(20).
在一个针对化疗无效的low grade lymphoma与转化型(transformed)淋巴瘤病人之第
三期临床试验中,随机把病人分配到两组治疗组: Y-90 ibritumomab和rituximab.使用Y-90
ibritumomab的病人有较高的整体反应率及完全缓解率,并且达到统计上的显著差异,但是
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两组病人在存活率上并未显著不同(21).FDA於2002年2月19日核准其用於复发或对化疗
具抗药性的low grade or follicular or transformed B NHL的病人,也可以使用於对rituximab
反应不好的病人.I-131 tositumomab也於2003年6月27日以相同的适应症得到FDA核准.
最近的研究指出,以I-131 tositumomab治疗曾接受过rituximab的low grade or
transformed B NHL患者,可以达到65%的整体反应率,完全缓解率则为38%.这群病人中
有60%对之前的rituximab没有反应,由此可见I-131 tositumomab的优异疗效.进一步分
析发现,I-131 tositumomab对细胞型态较好(grade 1- 2)且肿瘤小於7公分的病人较有效.
此外I-131 tositumomab的效果与病人对之前rituximab的反应没有相关性.副作用方面,有
五成病人有严重但短暂的骨髓抑制,还有两人后来发生骨髓发育不全症候群(myelodysplastic
syndrome,MDS)(22).
在另一个最近的临床试验发现,以I-131 tositumomab来作为细胞型态第一与第二级,
且分期第三期以上follicular lymphoma的初始治疗,其整体反应率高达95%,完全缓解率
75%.骨髓侵犯越少或肿瘤越小,反应率越好;另一方面,分期越高或骨髓侵犯越严重,病
人越容易复发.多变项分析的结果显示只有骨髓侵犯程度在统计上有显著意义.整体而言,
五年无复发率为59%;完全缓解的病人,五年无复发率是77%.在完全缓解的病人中,有
20个在治疗前被证实有染色体14和18转位,其中有16人在治疗后半年此染色体转位消失
了; 这群临床完全缓解及分子层次亦缓解的病人,有八成在五年后都没有复发.所以用
I-131tositumomab为分期较高low grade lymphoma病人的初始治疗是合理的策略(23).
Gemtuzumab ozogamicin(Mylotarg )
Gemtuzumab ozogamicin(GO)是由anti-CD33 monoclonal antibody和calicheamicin
毒素结合而成.CD33在急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)的French-
American-British分类M1- M4细胞上皆有表现,而CD33在正常骨髓干细胞上并不表现.所
以GO是一个治疗CD33阳性之AML的理想单株抗体.GO接合上细胞表面的CD33后,与
CD33一起进入细胞内(internalization)来产生毒杀作用.
患有AML的老年人由於较可能有其它系统性疾病,而且对化学治疗耐受性较差,化疗的
反应率不理想且容易复发,所以整体的治疗成绩十分不好.使用GO治疗患有AML的老年人,
目的就是希望藉由单株抗体的特异性与较低的毒性来提升治疗成绩.
综合3个多机构临床试验结果的分析显示,在化疗缓解后第一次复发且平均年龄61岁
的病人,相隔两周投予两剂9 mg/m2的GO,可使三成病人达到缓解.常见毒性包括:输注
GO造成的发烧寒颤,肝功能上升,肝内静脉阻塞性疾病(veno-occlusive disease,VOD).
美国FDA於2000年5月17日核准GO使用於第一次复发且大於60岁的CD33阳性AML
病人,或不适合再做化疗的病人(24).GO也可用在小於60岁的AML病人,和化疗合用以加
强初始缓解率(induction)或在缓解后强化疗效(consolidation),但若与化疗合用剂量需减
低到3-6 mg/m2,以减轻异常肝功能及VOD的机率(25).
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Alemtuzumab(Campath-1H )
Alemtuzumab是对抗CD52的单株抗体.用来治疗CD52阳性的慢性淋巴球性白血病
(chronic lymphocytic leukemia,CLL).一般的使用为每周静脉注射三次,每次30 mg,若
病人可以承受输注的反应,可治疗至12周.要注意的是,因为alemtuzumab同时抑制B和
T细胞,造成细胞免疫力下降,需同时使用预防性药物以防疱疹病毒和肺囊虫感染.在疗效
方面,在未接受过化疗的CLL病人使用后,反应率高达九成,完全缓解率约两成;若使用在
已接受过化疗的病人,整体反应率大约在33%到70%之间,而完全缓解率不到一成.使用
在T-CLL时,有50%-70%的整体反应率和40%-60%的完全缓解率.美国FDA於2001年
5月7日核准alemtuzumab用於对化疗无效的CLL病人.另外也有人尝试把化疗和
alemtuzumab合并使用,最常与fludarabine合并以治疗CLL病人,但两者合并使用有严重
的免疫抑制作用,甚至有巨细胞病毒感染的报告.也有小规模临床试验报告,用alemtuzumab
治疗CD52阳性的急性淋巴芽球性白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL),能达到完
全缓解的效果(26).
另外,alemtuzumab也被用来治疗许多CD52阳性的恶性血液疾病,例如表皮T淋巴瘤
(cutaneous T-cell lymphoma,CTCL)(27)ヽ第一型人类T淋巴球白血病病毒(human T-cell
leukemia virus-1,HTLV-1)相关的成人T细胞白血病或淋巴瘤(adult T-cell lymphoma/
leukemia)ヽ周边T细胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma)ヽWM(19),及肝脾T淋巴瘤
(28).在T-NHL患者接受自体干细胞移植前,可使用alemtuzumab以清除骨髓中的残余淋巴
瘤(29).
仍在发展中的药物
Anti-CD22 monoclonal antibody
CD22通常在较成熟的B淋巴球上表现,包括发细胞白血病(hairy cell leukemia),B-CLL
的血癌细胞皆为此类型之B细胞.Epratuzumab是抗CD22单株抗体,使用於follicular
lymphoma的整体反应率为18%,DLBC的整体反应率为10%.但是有关在B-CLL的临床
使用资料很少,甚至有零星报告显示效果不好.BL-22为抗CD22单株抗体加上绿脓杆菌毒
素,此药可直接造成细胞凋亡,最早是用於发细胞白血病,现在被尝试用来治疗B-CLL(18).
Anti-HLA-DR monoclonal antibody
Apolizumab是针对B细胞上HLA-DR的单株抗体,原本设计用来治疗low grade and
follicular B NHL与B-CLL.但在针对CLL与low grade lymphoma的第一及第二期临床测试,
结果不如预期的好(18).
cAC-10-vcMMAE
何杰金氏症的淋巴瘤细胞上大多都有表现CD30,cAC-10为抗CD30 单株抗体;
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vcMMAE为一种化疗药物auristatin E,可抑制微小管(microtubule)使细胞不易分裂.在老
鼠实验中,使用cAC-10-vcMMAE这种单株抗体和化疗复合物治疗CD30阳性的肿瘤已有初
步的疗效(30).
抗携铁蛋白受体的单株抗体
急性型的adult T-cell lymphoma/ leukemia细胞上表现很多携铁蛋白受体(transferrin
receptor),A24是一种可攻击此受体的单株抗体,造成铁无法进入血癌细胞而造成细胞凋亡
(31).
双特异性抗体(bispecific antibody)
HRS-3/A9:针对在何杰金氏症细胞上的CD30与自然杀手细胞上的CD16.SHR-1:针
对在NHL细胞上的CD19与毒杀性T细胞上的CD3.251/22:针对在AML细胞上的CD33
与单核球上的CD64.这些双特异性抗体都还在第一期或第二期临床试验中(32).
3. 在固态肿瘤的临床应用
Edrecolomab
这是一种针对癌细胞表面的17-1A糖化蛋白的单株抗体.17-1A最常表现於大肠直肠癌
的癌细胞,在乳癌,肺癌与摄护腺癌的癌细胞上也有表现.在大肠癌第三期病人手术后给予
500 mg,之后每个月一次给予100 mg,连续四次作为术后辅助性治疗,其整体存活率高於
只有接受开刀治疗的病人.但是第三期随机临床试验显示其效果不如术后辅助性化疗(33).
Oregovomab
这是一种针对卵巢癌特有的CA-125(cancer antigen)之单株抗体,卵巢癌第三与第四
期的病人在接受完手术及辅助性化疗后使用,可作为强化治疗(consolidation),确实的疗效
有待进一步的临床试验证实(33).
其它
Y-90 anti-CEA(carcinoembryonic antigen):针对表皮细胞癌,第一,二期临床试验中.
G250:针对肾细胞癌的单株抗体.Anti-PSA(prostate-specific antigen):治疗摄护腺癌.
Anti-GD2/3(ganglioside;神经胶脂):用於治疗黑色素瘤(33).另外,Anti-VEGF单株抗体
与anti-EGFR单株抗体请见后文表皮生长因子受体与血管新生部分的介绍.
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三,表皮生长因子受体相关的分子标靶治疗(epidermal growth factor
receptor-related molecular-targeted therapy)
1. 表皮生长因子受体在癌细胞的重要性
表皮生长因子受体有四种: (1)ErbB-1(又称EGFR);(2)ErbB-2(又称HER-2/Neu);
(3)ErbB-3;(4)ErbB-4.这些受体延伸至细胞内的部份,除ErbB-3外,皆具有酪胺酸激
酶(tyrosine kinase,TK),当TK和ATP接合后会将细胞内受体上的酪胺酸根磷酸化,进而
活化下游的讯息传递路径来刺激细胞生长.
表皮生长因子(EGF)是一种生长促进因子,会接合到具有表皮生长因子受体的组织器
官以调控许多生理机能.癌细胞会因为受体过度表现或生长因子不受调控,而过度生长促进
癌化过程.具有表皮生长因子接受体的肿瘤非常多,包括了肺癌,乳癌,胃癌,大肠癌与头
颈部癌等.很多肿瘤都可能表现过量的表皮生长因子受体,而伴随比较差的预后,这表示表
皮生长因子受体的传导路径在癌化过程与癌症进展中有重要角色.
除EGF以外,alpha转形生长因子(transforming growth factor-alpha,TGF-alpha),
第一型胰岛素生长因子(insulin growth factor-1,IGF-1),及碱性纤维母细胞生长因子(basic
fibroblast growth factor,bFGF)也会接合上表皮生长因子受体,但至今尚未发现可连结上
ErB-2的生长因子.受体接合这些生长因子后会双体化(dimerization),可以形成homodimer
(两个一样的受体)或heterodimer(两个不同的受体).ErbB-2最容易和别的受体形成
heterodimer.最常见的三种heterodimer为ErbB-2/ErbB-3,ErbB-2/ErbB-4,ErbB-1/ErbB-4.
ErbB-2/ErbB-3是最强而有力促成细胞生长转型的heterodimer.ErbB-3因为缺乏细胞内部
的酪胺酸激酶,若形成homodimer会没有生理作用.
双体化之后的表皮生长因子受体会活化彼此细胞内酪胺酸激酶区,进一步活化下游不同
的讯息传递路径,例如:(1)PI3K/ AKT路径(此路径使细胞不易进行细胞凋亡);(2)Ras/
Raf/ MEK/ MAPK路径;(3)STAT路径.以上路径的讯息传递若失去正常调控,会造成细胞
过度生长,抑制细胞凋亡,增加血管新生,增加肿瘤的侵犯与转移能力.
目前已知在许多状况会发生表皮生长因子受体失去正常调控,例如(1)EGF,TGF-
alpha,IGF-1,bFGF过多时;(2)表皮生长因子受体在细胞上过度表现;(3)表皮生长因
子受体产生基因变异,使其和生长因子的接合能力上升;(4)不经接合生长因子就自行双体
化,磷酸化,活化下游路径;(5)细胞内对此路径的促进因子增多,或抑制因子减少,造成
调控失去平衡.以上各种情况会使细胞不受抑制地循EGFR路径不停生长,也会造成肿瘤对
化疗与放射治疗的效果不好.所以表皮生长因子受体与其下游讯息传递路径是一个重要的治
疗标靶,值得发展药物治疗(34).
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2. 临床应用
Trastuzumab(Herceptin )
25%-30%乳癌患者为HER-2/Neu阳性,而且表现者会有较差的预后且对荷尔蒙治疗有
抗性.其过度表现是因为基因的多体化(amplification),表现越强者愈
为什么单克隆抗体可用于治疗器官移植后的排异作用
这样的抗体是经过改造的，比如人源化就可以有效降低器官移植后的排异作用。人源化抗体（humanized antibody）又称互补决定区移植抗体 ，是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体和全人源化抗体等。 嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。改型抗体也称CDR植入抗体(CDR grafting antibody)，抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。所替换的片段不应过多, 对于影响侧链大小、电荷、疏水性, 或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构像的残基尽量保留。全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。目前，已建立多种方法生产完全人源性抗体，主要有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽融合技术。
什么是单克隆抗体？有何特点及应用价值？
分类：分子生物学知识 字号： 大大 中中 小小 1975年Kohler和Milstein首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。他俩首先创立了将能分泌特异性抗体的B淋巴细胞同无限繁殖的骨髓瘤细胞融合技术,为单克隆抗体的制备奠定了基础。这是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。
所谓的单克隆抗体是指由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别某一特定抗原表位的同源抗体。
单克隆抗体是经过人工制备的一类特殊抗体,它具有一般抗体的性质;它是B细胞增殖分化为浆细胞所产生的一类球蛋白,存在于体液中,具有免疫功能 ,介导体液免疫;它能与相应抗原(如病原体)特异性结合,在其他免疫分子和细胞的参入下发挥免疫效应.
单克隆抗体的本质是球蛋白,具有球蛋白的理化性质,空间结构和生物学活性.球蛋白对热和化学物质敏感,加热和加入化学试剂易破坏其结构,具有一定的半衰期.它和球蛋白一样具有可变区和恒定区,可变区结合抗原,形成抗原抗体复合物;恒定区有补体结合位点,介导补体发挥作用,形成攻膜复合物,杀伤变异的细胞.
单克隆抗体除了具有抗体的一般性质外,还具有其特殊性.它在结构和组成上高度均一,其类型抗原结合特异性和亲和力完全相同,易于体外大量制备和纯化,可以广泛的应用于医学和微生物学领域.单克隆抗体有小鼠免疫脾细胞(B细胞)和无限繁殖的骨髓瘤细胞融合在一起形成一个杂交瘤细胞.而这个杂交瘤细胞不仅具有无限繁殖的能力,还具有分泌抗体能力,因此在体外培养后,可无限的分泌抗体.
单克隆抗体的制备比较复杂,其中涉及多种生物学技术,在此简述其过程.用特定的抗原免疫纯系动物(如BALA--C小鼠),多次反复经背部皮下多点注射,每次注射应定量,也要注重接种的时间间隔,可适当的添加弗氏佐剂.经过一段时间的饲养后,选择血清抗体高的接种动物在无菌的情况下处死,取出脾脏剪碎,分离,离心取其悬浮细胞置入培养皿中,备用.在另取纯系小鼠的骨髓瘤细胞放进培养皿中,加入一些饲养细胞(如胸腺细胞,巨噬细胞)促使其生长,在该混合液中有多种细胞,为了提取目的细胞--杂交瘤细胞,必须进行HAT选择,培养获得纯代杂交瘤细胞.在众多的杂交瘤细胞中,有的不表达免疫球蛋白,有的表达其他类型的球蛋白,因此,要用特异性的检测方法从众多的细胞中筛选出阳性杂交瘤细胞.将目的细胞分离成单个细胞让其克隆化形成细胞株,再转移至其他培养基中扩大培养.为了大量的获得抗体,还需要经过小鼠腹腔接种,然后从腹水中分离提纯抗体.
单克隆抗体的分离,提纯,检验.将体外扩大培养液或者小鼠腹腔接种的腹水装入离心管中置于离心机上高速离心,取其上清液置于玻片上,加入相应的抗原,看是否有凝聚现象.
单克隆抗体问世后取得了辉煌的成就,如应用白喉外毒素单克隆抗体治疗白喉棒状杆菌;应用抗内毒素类脂A的单克隆抗体治疗G~菌败血症等.单克隆技术也因此获得了1984年的诺贝尔医学奖.它的主要作用是:用单克隆抗体代替多克隆抗体克服了交叉反应,提高了免疫学实验的特异性和敏感性,从而促进了医学检验学的发展;用单克隆作亲和柱,可分离提纯含量极底的可溶性的抗原,如激素,细胞因子和难以纯化的肿瘤抗原等;为物质提纯开辟了一条新途径;制备的单克隆抗体识别细胞表面特异性受体,若将抗肿瘤药物(如毒素或放射性物质)偶连到其上,构建生物导弹,有望攻克人类顽疾--肿瘤.
单克隆抗体有广阔的发展前景,但有其局限性.单克隆抗体作为外源性的抗原,多次反复的注射后能促使机体发生免疫应答,产生相应的抗抗体,产生排斥现象,因此单克隆抗体应用于临床有其风险性,在紧急预防的情况下,可以慎用.
总之,单克隆抗体为人类在检验疾病,治疗疾病方面取得了重大突破,尽管它还有些弊端,相信在不久的将来人类会制备出更加优良的单克隆抗体,为攻克肿瘤作出更大的贡献!
单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。
1 作为亲合层析的配体
单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。
2 作为生物治疗的导向武器
脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。
3 作为免疫抑制剂
抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。
4 作为研究工作中的探针
单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。
5 增强抗原的免疫原性
抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。
6 作为医学检验试剂
单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：
(1)诊断各类病原体
这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。
(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测
用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。
随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。
(3)检测淋巴细胞表面标志
用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。
(4)机体微量成分的测定
应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。
综上所述，单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于鼠源性，用于人类疾病的预防和治疗时会产生异种蛋白变态反应，大大限制了其临床应用价值。而且，鼠源性抗体在人体内半衰期缩短，生物活性降低。因此，人们一直致力于人源性抗体的研究，如用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；用EB病毒转化人的B淋巴细胞；用基因工程法制备嵌合抗体等。但都遇到相当的困难。以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库是近年来形成的最新方法。以该技术制备的抗体片段(Fab)是人源抗体，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。
单克隆抗体综述
一、抗体的定义和第一代单克隆抗体（经杂交瘤细胞生产）
抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。70000之间，称为“重链”（H链）。轻、重链之间和两重链之间由二硫桥连接，这样的四链结构（L2H2）组成一个免疫球蛋白分子。550个氨基酸残基，相对分子质量在55000;抗体的基本结构如图所示，由四条肽链组成，其中两条相对分子质量较低的肽链约含210个氨基酸残基，相对分子质量约24000，称为“轻链”（L链）；另两条相对分子量较高的肽链约含450，其相应的抗体分别命名为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。以重链抗原性差异来进行抗体的血清学分类：用分离纯化的各种重链免疫动物获得相应的抗血清，再通过免疫交叉反应等血清学检测方法，分析其结构的异同，反复的验证，最后发现人类有5类不同的重链，分别为）与多种细胞结合，(5)可能造成免疫损伤。IgG占成人血清中抗体总量的75%以上，是人类血清中主要的一类抗体，由B细胞产生，其功能结构也是研究最清楚的。它主要的生理功能有：(1)中和毒素和病毒，(2)凝集和沉淀抗原，(3)激活补体，(4)通过特异的膜受体（Fc单克隆抗体技术的应用是现代生物科学领域中的重要进展之一。单克隆抗（Monoclonalantibody，简称McAb）具有广泛的应用价值，它为生物学和医学等自然科学的研究开辟了新的途经。
二、 第二代单克隆抗体：经过基因重组的嵌合或人源化单克隆抗体
嵌合抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。嵌合抗体成功的例子有：
Rituxan：Idec Pharmaceutical/Genentech的小鼠抗CD20抗体，含人IgG1κ恒定区，用于治疗B淋巴瘤。它的抗淋巴瘤作用主要可能来自于补体作用、ADCC和诱导肿瘤细胞凋亡。
Remicade：Centocor公司的抗TNF-α抗体，用于治疗风湿性关节炎和节段性回肠炎。
Simulect: Novartis公司的抗CD25抗体，用于抗移植排斥。
Erbitux：美国Imclone公司的抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，目前FDA已批准其用于治疗结直肠癌。
人源化抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。
成功的例子：
Herceptin：Genentech公司的抗HER2/neu抗体，用于治疗乳腺癌。
Synsgis：Medimmune公司的抗F抗体，用于治疗呼吸道病毒感染。
Zenapax：Protein Design Labs（PDL）/Roche的抗CD25抗体，用于抗移植排斥。
h-R3：古巴分子免疫学中心的抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，用于治疗头颈癌。
三、 噬菌体展示抗体和全人抗体
（1）噬菌体显示技术制备人源性抗体
基于噬菌体可把抗体片段表达在外膜的能力而建立一系列的抗体文库，然后用目的抗原来筛选文库中相应的抗体片段，再经体外加工可形成有功能的完全人抗体。用此方法可制备针对简单或复杂抗原的单抗，并得到中等亲和力的抗体，但该方法需用高通量筛选。现有一些已进入临床II/III期研究，如Cambridge Antibody Technology（CAT）的D2E7和CAT-152，分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼。D2E7是抗TNF-α单抗，现正由Abbott Laboratories开发。从其2002年6月份提供的临床III期数据看，有望于近期进入市场。
（2）转基因动物制备人源性抗体
抗体衍生物：有的研究者正在开发更容易生产和使用的单抗衍生物，最成功者当属宾夕法尼亚大学的Mark Greene。他在寻找抗体互补决定区CDR衍生的多肽小分子[16]，并成立了CDR Therapeutics（现属Xcyte Therapies）以加速其多肽生产的商业化。他的多肽有亲本单抗的亲和力和选择性，但作为小分子，多肽应无免疫原性，且更容易制备。
异体器官移植患者服用什么可以预防排斥反应
由于人群中很难找到HLA完全一致的供受者，因此，除同卵双生的器官移植外，其他同种异体组织或器官移植都会发生排斥反应。而器官移植术的成败在很大程度上取决于移植排斥反应的防治，目前临床上主要从严格选择供者、抑制受者免疫应答、诱导移植耐受以及加强移植后的免疫监测等来防治移植排斥反应发生。
移植物和受者的预处理
移植物预处理
实质脏器移植时，尽可能清除移植物中过路细胞有助于减轻或防止移植排斥反应发生。同种骨髓移植中，为预防可能出现的移植物抗宿主反应，可对骨髓移植物进行预处理，其原理是基于清除骨髓移植物中的T细胞。但应用去除T细胞的异基因骨髓进行移植，可能发生的移植物抗白血病效应也随之消失，导致白血病复发率增高，从而影响患者的预后。
受者预处理
实质脏器移植中，供、受者间ABO血型不符可能导致强的移植排斥反应。某些情况下，为逾越ABO屏障而进行实质脏器移植，有必要对受者进行预处理。预处理方法包括：术前给受者输注供者特异性血小板、借助血浆置换术去除受者体内天然抗A或抗B凝集素、受者脾切除、免疫抑制疗法等。
抑制受者的免疫应答
如果不进行干预，同种移植术后一般都会发生排斥反应，故临床移植术成败在很大程度上有赖于对受者免疫应答的适度抑制。常用的抑制受者免疫应答的方法分为以下几类：
化学类免疫抑制药
糖皮质激素，代表药物：甲泼尼龙，强的松。作用机制：主要是抑制核转录因子KB的活性。糖皮质激素的免疫学作用主要表现在减少淋巴细胞产生细胞因子，影响T细胞激活和黏附，但在大剂量进行冲击治疗时，还可通过直接作用造成淋巴细胞溶解和凋亡，以达到快速有效地抑制免疫作用。不良反应：由于长期应用糖皮质激素可诱发和加重感染，或导致肾上腺皮质功能紊乱等，故在器官移植中，糖皮质激素与其他免疫抑制剂联合应用，能产生良好的协同作用。
细胞毒类药物，代表药物：硫唑嘌呤片，环磷酰胺。作用机制：抑制免疫器官中DNA、RNA及蛋白质合成，从而抑制淋巴细胞增殖反应。硫唑嘌呤是最早应用的一种免疫抑制药物。不良反应：硫唑嘌呤的主要不良反应为骨髓抑制和药物性肝炎。用药期间应监测全血计数和肝功能。
钙调蛋白抑制剂，代表药物：环孢素A，他克莫司。作用机制：抑制神经钙蛋白活性，从而抑制T淋巴细胞活化分泌白细胞介素2；同时也抑制T淋巴细胞的白细胞介素2受体的表达，从而有效地抑制T淋巴细胞的活化与增殖。不良反应：环孢素A的不良反应主要表现在心血管、肾脏和中枢神经系统，环孢素A对B淋巴细胞也有一定影响，不仅阻止B淋巴细胞的增生，还可以诱发和促进B淋巴细胞程序化死亡。长期应用也可引起脾脏淋巴细胞的减少，造成脾脏萎缩。
抑制细胞因子增殖反应药物，代表药物：雷帕霉素。作用机制：抑制由抗原及细胞因子白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6诱导的T细胞增殖和脂多糖诱导的B细胞增殖，肾毒性非常低，但有剂量依赖性，并且是可逆的。不良反应：可造成高胆固醇血症和高甘油三酯血症、感染、血液系统损害等不良反应。
干扰代谢药物代表药物，代表药物：霉酚酸酯，咪唑立宾。作用机制：竞争性抑制嘌呤合成系统中肌苷酸至鸟苷酸途径从而抑制核苷酸合成。不良反应：霉酚酸酯的不良反应主要为腹泻、白细胞减少及机会性感染。咪唑立宾主要不良反应有胃肠反应、血液系统障碍和过敏症状，偶见骨髓抑制和急性肾功能衰竭。咪唑立宾不在肝脏代谢，并证明没有明显的肝毒性，骨髓抑制也不明显，而免疫抑制效果与硫唑嘌呤相近，故被用作硫唑嘌呤的替代品。
FTY720可使外周血中的T、B淋巴细胞数减少，从而对移植物的攻击减弱。由于FTY720具有高度的细胞选择性，毒副作用低，避免了环孢素A过量所可能引起的肝、肾毒性。
目前已用于临床的生物制剂主要是某些抗免疫细胞膜抗原的抗体，如抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗CD3、CD4、CD8单抗、抗高亲和力ID2R单抗、抗TCR单抗、抗黏附分子(1CAM-1、LAF-1)抗体等。这些抗体通过与相应膜抗原结合，借助补体依赖的细胞毒作用，分别清除体内T细胞或胸腺细胞。某些细胞因子与毒素组成的融合蛋白、抗细胞因子抗体、某些黏附分子与免疫球蛋白组成的融合蛋白(如CFLA-4-Ig)等也具有抗排斥作用。
某些中草药具有明显免疫调节或免疫抑制作用。国内文献已报道某些中药如冬虫夏草等可用于器官移植后排斥反应的治疗。
清除预存抗体
移植前进行血浆置换，可除去受者血液内预存的特异性抗体，以防止超急性排斥反应。
其他免疫抑制方法
临床应用脾切除、放射照射移植物或受者淋巴结、血浆置换、血浆淋巴细胞置换等技术防治排斥反应，均取得一定疗效。在骨髓移植中，为使受者完全丧失对骨髓移植物的免疫应答能力，术前常使用大剂量放射线照射或化学药物，以摧毁患者自身的造血组织。
移植后的免疫监测
在临床工作中，移植后的免疫监测极为重要。早期发现和诊断排斥反应，对于及时采取防治措施具有重要指导意义。
排斥反应的临床判断主要依靠症状和体征、移植物功能状态及实验室检测等综合指标。超急排斥很容易诊断，急性排斥和移植物抗宿主反应的临床表现较明显，慢性排斥多无典型临床表现。移植器官的功能测定根据移植物不同而异，多需做大量的生化测定和血液学指标，某些辅助检查例如B型超声和彩色多普勒等对了解移植器官的形态、血管通畅性和血流量等也有一定的帮助。免疫学监测是在排斥反应发生之前检查受者体内参与反应的免疫细胞及某些免疫分子的变化，对判断患者是否会出现排斥反应有重要的参考意义[3]。
外周血T细胞计数
用单克隆抗体免疫荧光法或流式细胞仪可以测定T细胞及其亚群。在急性排斥的临床症状出现前1～5天，T细胞总数和CD4/CD8比值升高，巨细胞病毒感染时比值降低。一般认为当比值大于1.2时，预示急性排斥即将发生；比值小于1.08则感染的可能性很大。如果能进行动态监测，对急性排斥和感染的鉴别诊断会有重要价值。另外，淋巴细胞转化试验对测定T细胞总数和功能状态也有一定意义。
杀伤细胞活性测定
移植后因免疫抑制剂的应用，杀伤细胞的活性受抑制，但在急性排斥前会明显增高。取供者淋巴细胞灭活后作为刺激细胞，分离患者淋巴细胞作反应细胞，将两种细胞混合直接做CML，测得的结果是Tc细胞和NK细胞共同作用的结果；进行动态监测的意义更大一些。
血清 IL-2R测定
T细胞激活后可释出IL-2R，在急性排斥和病毒感染时IL-2R的血清含量升高，以巨细胞病毒感染时增高最明显。环孢霉素A肾毒性的肾功能减退时血清肌酐值增高，而IL-2R明显降低。血清肌酐值和IL-2R同时增高对急性排斥的诊断有意义。但个体间血清IL-2R的含量差别显著，无公认的诊断标准，限制了它的临床的应用，动态测定可克服这一缺点。
抗供者HLA抗体的检测
利用交叉配合试验检测患者血清中是否存在抗供者HLA的抗体，抗体的存在预示着排斥反应的可能性。
其他方法如血清补体测定等也有报道，但其意义不确切。必须指出，以上指标均有一定参考价值，但都存在特异性不强、灵敏度不高等问题。如何建立一套能指导临床器官移植的免疫学监测方法，是有待深入研究的重要课题。
人源化抗体的介绍
人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。1.人-鼠嵌合抗体此抗体为通过基因工程技术，将人IgG C区与鼠IgV区连接，导入细胞内表达制备而成的抗体。2.抗体的表面修饰，使Fv表面人源化。