实时荧光定量PCR的结果该怎样分析？
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；2、一般都是相对量，则用deltadeltaCT方法来计算；3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。扩展资料：PVR的循环参数：1、预变性；模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。2、变性步骤；循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。3、引物退火；退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。4、引物延伸；引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。5、循环数；大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸；在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。参考资料来源：百度百科—实时荧光定量PCR
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理如下：荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。传统的PCR进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离，并且只能作定性分析，不能准确定量，易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是3—15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果，但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取，实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。
pcr荧光探针法是什么?
pcr荧光探针法是是SYBRGreen掺入到双链DNA中的量。SYBRGreen掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链，它都掺。而探针法是当探针结合到目标序列上以后，聚合酶降解探针后，探针上自带的荧光基团离开淬灭基团，从而发出荧光。荧光pcr检测PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上，PCR扩增时，Taq酶的5端，3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离。
pcr荧光探针法是什么？
实时定量聚合酶链反应 (Quantitative Real-time PCR，qPCR) 是一种分子生物学技术，用于放大和同时检测或量化靶向 DNA 分子。程序遵循 PCR 的一般原则。在 PCR 反应过程中，随着循环次数的增加，PCR 产物的积累导致荧光信号的增强。因此，通过监测荧光强度，在"实时"中检测到 PCR 反应的进展。科学研究中较为常用的是 SYBR Green qPCR 和T aqMan 探针 qPCR。荧光PCR是一种用于生物学领域的分析仪器，于2003年1月3日启用。高灵敏度：可检测单拷贝基因；动力学范围广：可检测10E0——10E8 拷贝；高重复性：CV<0.3%；高分辨率：轻松区分1000拷贝以下2倍浓度差异；高速：60分钟完成40个PCR循环；罗氏lightCycler 采用Therma－BaseTM 热循环专利技术和先进的光学检测系统，彻底消除边缘效应，保持稳定优异的检测结果1个检测通道轻松实现多重或多色PCR。
实时荧光定量PCR的结果该怎样分析？
1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算；3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。扩展资料：PVR的循环参数：1、预变性；模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。2、变性步骤；循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。3、引物退火；退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。4、引物延伸；引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。5、循环数；大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸；在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。参考资料来源：百度百科—实时荧光定量PCR
荧光pcr法是什么？
荧光pcr法是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。也叫实时荧光定量PCR技术。荧光-PCR法技术原理：将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中。在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
荧光定量PCR技术有什么特点？
影响荧光PCR的因素很多，但从操作和技术上来讲应该要注意一下几点：
1.
RNA的完整性
因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量，所得的结果也是错误的。所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA酶的污染。
2.
RNA样品中的基因组DNA污染
提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA对试验有两个影响：一是影响对RNA的精确定量；二是影响PCR扩增的特异性。
3.
PCR反应体系的优化
PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物，为此，首先要保证PCR反应体系达到最优。目前许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒，可以方便PCR反应的操作。
4.
反转录
反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量，反转录对于实时定量PCR来说是非常关键的一步。目前常用的反转录酶有2种：AMV-RT和MMLV-R。反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT和特异引物。相比之下Oligo-dT和特异性引物更适合实时定量PCR。
5.利用实时定量PCR研究基因表达时，一般用相对定量的方法相对定量必须用到内标基因。可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因。常用的内标基因有β-tublin、actin、
GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等。尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定，但是
最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化。也就是说并不是任何内标基因都适合
任何试验。在选择内标基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内标基因或内标基因组合。
概述荧光定量PCR技术的原理。
又称实时PCR技术。该技术在常规PCR基础上，添加了一条标有两个荧光基团的荧光双标记探针，一个标记在探针的5′端称为报告基团(Reporter，R)；另一个标记在探针的3′端称为荧光抑制基团或称淬灭基团(Quencher，Q)。两者可构成能量传递结构，即5′端R发出的荧光信号可被3′端R基团抑制。3′端的-OH已被封闭，不具有延伸的能力。探针引物在无特异性PCR扩增时，荧光信号不改变。在PCR反应开始后，随着链的延长，荧光定量PCR的Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合部位，发挥它的5′-3′外切酶活性，将荧光探针切断。一但切断，Q基团的抑制作用消失，从而引起R基团的荧光信号增长，被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系，因此R基团的荧光信号的强弱就与PCR产物的数量成正比关系。测定出前者就可以推算出后者。这就是荧光定量PCR的原理。在PCR的过程中，连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值，即阈值)，此时循环次数(ct)就被记录下来，该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，利用阳性梯度标准品的ct值，制成标准曲线，再根据样品的ct值就可以准确定出起始DNA的拷贝数。