双缩脲法测定蛋白质含量计算
双缩脲法测定蛋白质含量计算如下：学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法实验原理：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与铜离子形成紫红色配位化合物，其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适用于1~10mg/mL，双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。实验操作：取双缩脲试剂、10mg/mL的标准蛋白溶液和待测蛋白溶液（稀释10倍的人血清），按下表配制6支溶液：紫外吸收测定法目的要求：了解紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。掌握紫外分光光度计的使用方法。实验原理：蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm 波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此。广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。此法的缺点是∶（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。（2）若样品中核酸等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。
双缩脲法测定蛋白质含量
双缩脲法测定蛋白质含量实验方法如下：实验目的： 1.掌握分光光度计的使用方法。 2.掌握标准管法测物质含量的方法。 3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。 一、原理： 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。 蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu 2+ 络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度 成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。二、 试剂 和器材 试剂 : (1) 标准蛋白溶液（5mg/ml）:准确称取已定氮的酪蛋白(干酪素或牛血清白蛋白)用0．05mol/L氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。 (2) 双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜（CuSO 4 ·5H 2 O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC 4 H 4 O 6 ·4H 2 O）于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。 (3) 样品血清:动物血清用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。标准曲线法所用的血清需20倍稀释。 器材:分析天平、分光光度计、 恒温水浴箱、 试管 、 吸量管等三、操作方法： 1、取三支 试管 按下表操作2、摇匀，37℃ 水浴 20min后用 分光光度计 于540nm波长处比色，以空白管调零点，测得各管吸光度。3、计算： 血清 总蛋白 质(g／100ml）＝A 测 /A 标 ×0.005×100/0.1
蛋白质的定量方法有哪几种？
①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procedure，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。
蛋白质测定的方法
蛋白质测定的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法、紫外吸收法等。一、凯氏定氮法。1、凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。2、即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐。3、然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。二、双缩脲法。1、双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。2、双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。三、酚试剂法。1、取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液。2、在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。四、紫外吸收法。1、大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1至0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。2、取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液。3、每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。